เครื่องวัดการดูดกลืนแสง (UV-VIS Spectrophotometer)

UV-VIS Spectrophotometer เป็นเครื่องมือที่วัดการดูดกลืนแสงของแสงช่วงความยาวคลื่น 190-800 ηm UV-VIS Spectrophotometer ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในห้องปฏิบัติการเพื่อหาปริมาณสารอนินทรีย์ในตัวอย่าง เช่น ไนไตรท์ แอมโมเนีย ฯลฯ โดยวัดการดูดกลืนแสงของสารประกอบที่มีสีเทียบกับสารละลายมาตรฐาน

ธรรมชาติของแสง

แสงเป็นคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (electromagnetic wave) แสงมีความเร็วในสุญญากาศเท่ากับผลคูณของความยาวคลื่น (λ) และความถี่ (ν) แต่ความเร็วในการเดินทางจะเปลี่ยนไปเมื่อเดินทางผ่านตัวกลางอื่นๆ โดยมีความเร็วในการเดินทางเท่ากับ 2.9979 x 10^-16 ซม./วินาที/n (n = ดรรชนีหักเหของตัวกลาง, refractive index) แสงต่างชนิดกันจะมีความยาวคลื่นต่างกันและเคลื่อนที่ด้วยความเร็วแตกต่างกันความเข้มของแสงนิยมวัดในหน่วยกำลังเทียน (candle power) หรือลูเมน (lumen) ปริมาณแสงแปรผันโดยตรงกับความเข้ม (intensity) ของแสง ดังนั้นการวัดความเข้มของแสงจึงเป็นการวัดปริมาณแสงทางอ้อม

ความยาวคลื่นแสงนิยมแทนด้วยอักษรกรีกคือ λ (แลมบ์ดา, lambda) แสงแต่ละช่วงความยาวคลื่นถูกกำ หนดให้มีชื่อเรียกต่างกันตามข้อกำ หนดของ the Joint Committee on Nomenclature in Applied Spectroscopy ดังนี้ (ชูชาติ และเปรมใจ, 2525)

แสงที่มองเห็น (visible light) เป็นแสงสีขาวที่เกิดจากการรวมกันของแสงสีต่างๆ มีสีหลักอยู่ 7 สี คือ สีม่วง สีคราม สีน้ำเงิน สีเขียว สีเหลือง สีแสด และสีแดง มีความยาวคลื่นตั้งแต่ 400-700 ηm เมื่อแสงสีขาวตกกระทบวัตถุแล้วทำให้มองเห็นวัตถุเป็นสีใดแสดงว่าวัตถุดูดกลืนแสงสีอื่นหมดแต่สะท้อนแสงสีที่ตามองเห็นออกมา แต่ถ้าวัตถุนั้น ๆ ดูดกลืนแสงทุกสีไว้ได้หมดจะมองเห็นวัตถุเป็นสีดำ

แสงอุลตราไวโอเลต (ultraviolet light) มีความยาวคลื่นตั้งแต่ 210-380 ηm เป็นแสงที่มีคุณสมบัติในการทำให้อิเล็กตรอนของอะตอมเกิดการส่งผ่าน (electronic transmission) เมื่อร่างกายถูกแสงนี้เป็นเวลานานอาจเกิดอันตราย ตัวอย่างเช่น ผิวหนังไหม้เกรียม เยื่อบุลูกตาถูกทำลาย และอาจทำให้เกิดเป็นมะเร็งของผิวหนังได้ เนื่องจากแสงอุลตราไวโอเลตทำให้ไธมินเบส (thymine base) ในนิวเคลียสของเซลล์รวมตัวกัน

แสงอินฟราเรด (infrared light) เป็นแสงที่มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า สามารถทำให้โมเลกุลของวัตถุต่างๆ เกิดการสั่นสะเทือนอย่างรุนแรงจนเกิดความร้อนขึ้นมาก เนื่องจากวัตถุส่วนใหญ่ดูดกลืนแสงในช่วงความยาวคลื่นในช่วง 3,000-100,000 ηm ได้ดี ดังนั้นจึงนิยมใช้รังสีอินฟราเรดในการทำให้วัตถุต่างๆ แห้ง เพราะมีประสิทธิภาพในการทำให้แห้งสูงกว่าการใช้ความร้อนแบบธรรม-ดา

คลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า

กฎแห่งการดูดกลืนแสง

1.  กฎของแลมเบิร์ต (ค.ศ.1760) กล่าวว่า แสงที่ถูกดูดกลืนเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความหนาของตัวกลางที่แสงผ่าน

I_t = I_o x 10^-kt -----------------------(1)

การดูดกลืนแสงตามกฎของแลมเบิร์ต (lambert's law)

2. กฎของเบียร์ (Beer's law) กฎของเบียร์ (ค.ศ.1852) กล่าวว่า แสงที่ถูกดูดกลืนเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของสารในของเหลว ซึ่งเมื่อคำนวณเช่นเดียวกับกฎของแลมเบิร์ต จะได้สมการ

I_t = I_o x 10^-kc -----------------------(2)

A = εct -----------------------(4)

หรือ

A= -log T -----------------------(5)
ε = molar absorptivity สารแต่ละชนิดมีค่า ε คงที่ในแต่ละช่วงคลื่น
มีหน่วยเป็น mole^-1cm^-1
c = ความเข้มข้นของสารในหน่วย mole/L
t = ความหนาของสารละลายในหน่วย ซม.

ชนิดของเครื่องวัดการดูดกลืนแสง

1. ชนิดลำแสงเดี่ยว (single beam type) ใช้ลำแสงลำเดียวกันสำหรับวัดสารอ้างอิง(reference หรือ blank) และสารตัวอย่าง (sample) การวัดความเข้มแสงกระทำโดยปรับ 0 %T แล้วปรับ 0A หรือ 100 %T ด้วยสารอ้างอิง หลังจากนั้นวัดค่าของสารตัวอย่างในหน่วย A หรือ %T ชนิดลำแสงเดี่ยวมีข้อดีตรงที่มีองค์ประกอบน้อย และมีแสงผ่านไปยังสารตัวอย่างมากกว่าแบบอื่นๆ แต่มีข้อเสียตรงที่มีเสถียรภาพในการอ่านค่าต่ำและค่าเปลี่ยนแปลงได้ง่าย นอกจากนี้ยังไม่สามารถกวาด (scan) ดูการดูดกลืนของแสงต่างๆ อย่างต่อเนื่องได้

องค์ประกอบที่สำคัญของเครื่องวัดการดูดกลืนแสงแบบ single beam

2. ชนิดลำแสงคู่ ( double beam type) วัดความเข้มของแสงโดยการสะท้อนแสงที่ผ่านออกมาจากตัวแยกแสงให้ผ่านสารอ้างอิงและสารตัวอย่างสลับกัน ทำให้ความเข้มแสงที่ผ่านตัวอย่างลดลงครึ่งหนึ่ง วงจรจะขยายสัญญาณที่ได้จากการเปรียบเทียบสัญลักษณ์ที่ได้รับจากสารตัวอย่างกับสารอ้างอิงอยู่ตลอดเวลา ดังนั้นจึงมีเสถียรภาพในการวัดความเข้มของแสงดีมาก แต่เครื่องวัดชนิดนี้มีองค์ประกอบซับซ้อน เนื่องจากใช้ตัวไวแสงอันเดียวจึงต้องมีวงจรเลือกวัดสัญญาณ และใช้หลอดไฟฟ้ากำเนิดแสงมีกำลังส่องสว่างสูง จึงทำให้มีราคาแพงกว่าเครื่องมือชนิดลำแสงเดี่ยว

องค์ประกอบที่สำคัญของเครื่องวัดการดูดกลืนแสงแบบ double beam

วิธีใช้เครื่องวัดการดูดกลืนแสง

เครื่องวัดการดูดกลืนแสงแต่ละแบบอาจมีเทคนิคการใช้และวิธีการใช้แตกต่างกันบ้าง ซึ่งผู้ใช้ควรศึกษาคู่มือการใช้งานโดยละเอียดก่อน สำหรับวิธีใช้เครื่องวัดการดูดกลืนแสงโดยทั่วไปมีดังนี้(ชูชาติ, 2539)

1. ถอดถุงคลุมเครื่องออก

2. เปิดสวิทซ์ไฟฟ้าเพื่ออุ่นเครื่องนาน 10-30 นาที

3. ปิดแสงจากภายในหรือภายนอกไม่ให้ตกกระทบตัวไวแสง โดยการปิดฝาครอบช่องใส่คิวเวทท์และปิดช่องแสงออก

4. ปรับ 0%T ด้วยปุ่มปรับศูนย์ ค่าความเข้มของแสงควรจะคงที่ ถ้าไม่คงที่อาจเกิดจากการอุ่นเครื่องไม่พอ หรือเครื่องมือมีความผิดปกติ

5. เลือกความยาวคลื่นแสงที่ต้องการวัดโดยหมุนปุ่มเลือกความยาวคลื่น

6. เลือกตัวกรองตัดแสงรบกวนที่เหมาะสม

7. ใส่รีเอเจนต์อ้างอิง (reagent blank) ลงในช่องใส่คิวเวทท์ ปิดฝาช่องใส่คิวเวทท์

8. ปรับ 100%T หรือ OD ด้วยปุ่มควบคุมการปรับในขั้นตอนนี้ต้องกระทำทุกครั้งที่มีการเปลี่ยนความยาวคลื่นแสงที่ใช้วัด

9. ใส่สารตัวอย่างลงในช่องใส่คิวเวทท์ ปิดฝาช่องใส่คิวเวทท์

10. อ่านค่า %T หรือ A

11. ปิดสวิทซ์ไฟฟ้า ปล่อยให้เครื่องเย็นก่อนคลุมเครื่องด้วยถุงคลุมเครื่องมือ

ข้อควรปฏิบัติในการใช้งาน

เพื่อให้การใช้เครื่องวัดการดูดกลืนแสงมีความผิดพลาดน้อยที่สุดควรปฏิบัติดังนี้ (ชูชาติ, 2539)

1. เลือกใช้วิธีวิเคราะห์ที่เหมาะสม

2. เลือกสารตัวอย่างที่เหมาะสม (ไม่ขุ่นหรือมีสีอื่นๆ เจือปนมาก)

3. ปฏิบัติตามคำแนะนำในคู่มือการใช้งาน (operating manual) อย่างเคร่งครัด

4. ตั้งเครื่องมือในที่มีฝุ่นน้อย ความชื้นต่ำอุณหภูมิไม่สูง และควรตั้งห่างจากผนังเพื่อให้ความร้อนระบายออกได้ดี

5. ใช้เครื่องควบคุมโวลต์ (voltage stabilizer) ถ้าโวลต์ของกระแสไฟฟ้าที่จ่ายให้กับเครื่องมือ มีค่าเปลี่ยนแปลงเกิน 10% (198-242 โวลต์)

6. อุ่นเครื่องให้พอเพียงก่อนใช้งาน

7. ตรวจดูสภาพของหลอดไฟกำเนิดแสงเป็นระยะ ๆ พร้อมกับดูตำแหน่งที่ถูกต้องด้วย

8. ปิดหลอดไฟกำเนิดแสงเมื่อไม่ได้ใช้งาน

9. ปิดช่องแสงออกเมื่อไม่ได้วัดความเข้มของแสง เพื่อยืดอายุการใช้งานของหลอดไฟกำเนิดแสง

10. ใช้ความกว้างของช่องแสงออกแคบ เพื่อสร้างแสงสีเดียวที่มีช่วงความยาวคลื่นแคบ

11. ควรอ่านค่าความเข้มข้นของแสงในช่วง 15-80 %T เนื่องจากการตอบสนองของตัวไวแสงส่วนใหญ่เป็นเส้นตรง

12. ใช้คิวเวทท์ที่สะอาดและมีค่าความแตกต่างของ %T ต่ำ

13. ในกรณีที่มีคิวเวทท์น้อยจำเป็นต้องใช้ร่วมกัน ควรวัดสารละลายที่มีความเข้มข้นน้อยก่อนสารละลายที่มีความเข้มข้นมากตามลำดับ

14. ตรวจสอบความไวของตัวไวแสงเป็นระยะๆ

15. ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลง 100%T หรือ O Abs เป็นระยะ ๆ ในขณะที่ใช้งานเครื่องอยู่

16. มีการบำรุงรักษาเครื่องมือเป็นระยะๆ และสม่ำเสมอ