การวิเคราะห์หาคลอโรฟิลล์

คลอโรฟิลล์เป็นรงควัตถุสังเคราะห์แสงที่มีสีเขียว คลอโรฟิลล์ที่พบในแพลงก์ตอนพืชมีหลายชนิด แต่ที่รู้จักกันทั่วไปคือ คลอโรฟิลล์เอ นอกจากนี้ยังคลอโรฟิลล์บี คลอโรฟิลล์ซี และคลอโรฟิลล์ดี คลอโรฟิลล์เอ และบีมีสูตรทางเคมีดังนี้ C₅₅H₇₂O₅N₄Mg และ C₅₅H₇₀O₆N₄Mg ตามลำดับ คลอโรฟิลล์ละลายได้ดีในไขมันแต่ไม่ละลายน้ำ

คลอโรฟิลล์เอเป็นรงควัตถุสังคราะห์แสงที่พบมากในแพลงก์ตอนพืชที่ยังมีชีวิตทุกชนิด แต่พบในแพลงก์ตอนพืชที่ตาย แพลงก์ตอนสัตว์ และสสารที่ไม่มีชีวิตเพียงเล็กน้อยเท่านั้น จึงนิยมใช้คลอโรฟิลล์เอชี้ถึงมวลชีวภาพของแพลงก์ตอนพืชในแหล่งน้ำ ซึ่งคลอโรฟิลล์เอมีสัดส่วนประมาณ 0.5-2 % ของน้ำหนักแห้งของแพลงก์ตอนพืชฟีโอไฟตินเอ (phaeophytin a) เป็นคลอโรฟิลล์เอที่สลายตัวไปแล้ว ในการวิเคราะห์หาคลอโรฟิลล์เอนั้นฟีโอไฟตินเอสามารถรบกวนการวัดค่าคลอโรฟิลล์เอได้ เพราะสามารถดูดกลืนแสงในช่วงเดียวกับคลอโรฟิลล์เอ เมื่อวัดคลอโรฟิลล์เอควรจะวิเคราะห์หาฟีโอไฟตินเอด้วย สัดส่วนของคลอโรฟิลล์เอกับฟีโอไฟตินเอจะเป็นดัชนีที่บอกสภาพของคลอโรฟิลล์เอได้เป็นอย่างดีการวิเคราะห์หาคลอโรฟิลล์มี 3 วิธี คือ Spectrophotometric method, Fluorimetric method และ HPLC method วิธี Fluorimetric นั้นค่อนข้างจะไว (sensitive) และใช้ตัวอย่างน้ำน้อยกว่าวิธี Spectrophotometric

การวิเคราะห์หาคลอโรฟิลล์ด้วยวิธี Spectrophotometric (Strickland and Parsons, 1972)

เครื่องมือและอุปกรณ์

1. เครื่องวัดการดูดกลืนแสง

2. Clinical centrifuge

3. Tissue grinder มีส่วนประกอบด้วยคือ grinding tube และตัวอัดบด (pestle) ซึ่ง grinding tube จะต้องมีก้นกลม จึงจะสะดวกต่อการใช้งาน

4. Centrifuge tube เป็น test tube ที่มีเกลียวสำหรับปิดฝา (screw-cap tube) มีความจุ 15 มิลลิลิตร

5. ชุดกรอง ซึ่งประกอบด้วย vacuum pump และแผ่นกรองชนิดที่เป็น membrane หรือ glass fiber เช่น แผ่นกรอง GF/F แผ่นกรอง GF/C หรือ แผ่นกรองชนิด cellulose acetate

น้ำยาเคมีและวิธีเตรียม

1. สารละลายแมกนีเซียมคาร์บอเนต : ชั่งแมกนีเซียมคาร์บอเนต (MgCO₃) ประมาณ 1 กรัม ลงในน้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร

2. สารละลายอะซีโตน ความเข้มข้น 90 เปอร์เซ็นต์ (90 % acetone ) ผสมอะซีโตน(analytical grade) 9 ส่วน ต่อน้ำกลั่น 1 ส่วน (V/V) ในขวดวัดปริมาตร แล้วเก็บไว้ไม่ให้ถูกแสง

3. สารละลายกรดไฮโดรคลอริก เจือจางกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้นปริมาตร 10 มิลลิลิตร ด้วยน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตร 100 มิลลิลิตร

ขั้นตอนวิเคราะห์

1. กรองตัวอย่างน้ำ 100 มิลลิลิตรผ่านแผ่นกรอง membrane หรือ glass fiber ที่มี pore size ประมาณ 0.5 μm (ตัวอย่างเช่น แผ่น GF/F หรือแผ่น cellulose acetate) (กรณีไม่มีแผ่นกรองดังกล่าวใช้แผ่นกรอง GF/C แทนก็ได้) ขณะกรองตัวอย่างน้ำหยดสารละลายแมกนีเซียมคาร์บอเนต 2-3 หยด จากนั้นนำแผ่นกรองที่ได้ไปสกัดคลอโรฟิลล์ หากไม่สามารถทำได้ให้พับแผ่นกรองแล้วห่อด้วยกระดาษฟอยล์ นำไปแช่แข็งอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ซึ่งสามารถเก็บไว้ได้นาน 2-3 สัปดาห์

2. นำแผ่นกรองในข้อ 1 มาบดด้วยเครื่องบดเนื้อเยื่อ (tissue grinder) ก่อนบดให้เติมสารละลายอะซีโตน ความเข้มข้น 90 เปอร์เซ็นต์ ลงไปพอประมาณ (เพื่อให้คลอโรฟิลล์ละลายออกมามากที่สุดควรทิ้งไว้อย่างน้อย 10 นาที) แล้วบดจนแผ่นกรองละเอียด หลังจากนั้นเทสารละลายที่ได้ลงในหลอดฝาเกลียว แล้วปรับให้ได้ปริมาตร 5 มิลลิลิตร ถึง 10 มิลลิลิตร ด้วยสารละลายอะซีโตน 90 เปอร์เซ็นต์ เก็บในที่มืดอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 1 คืน (ใช้ผ้าดำคลุมหลอดตัวอย่าง เก็บไว้ในตู้เย็น)

3. นำสารละลายที่อยู่ในหลอดเกลียวมา centrifuge ด้วยความเร็ว 4,000 รอบ/นาที เป็นเวลา 20 นาที เอาสารละลายส่วนใสออกมาหาปริมาตรที่แน่นอน

4. จากนั้นนำไปวัดด้วยเครื่องวัดการดูดกลืนแสง โดยค่อย ๆ เทสารละลายลงใน cuvette อย่างช้าๆ ระวังอย่าให้เกิดตะกอนขุ่น(เพื่อป้องกันตะกอนขุ่น ให้ถ่ายเอาสารละลายเฉพาะส่วนที่ใสลงในหลอดทดลองใหม่แล้วนำไปปั่นที่ความเร็ว 4,000 รอบ/นาที เป็นเวลา 20 นาที อีกครั้ง) แล้ววัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 750, 663, 645 และ 630 นาโนเมตร โดยใช้ cuvette ขนาด 1 เซนติเมตร สำหรับแบลงค์ และ reference cell ใช้สารละลายอะซีโตน ความเข้มข้น 90 เปอร์เซ็นต์ การวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 750 นาโนเมตร นั้นใช้ปรับค่าเนื่องจากการรบกวนของความขุ่น เพราะค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 750 นาโนเมตร นั้นจะไวต่อการเปลี่ยนแปลงของความขุ่นอันเกิดจากการนำอะซีโตน ผสมน้ำในอัตราส่วน 9 : 1

5. เมื่อวัดค่าการดูดกลืนแสงเสร็จแล้ว เติมสารละลายกรดไฮโดรคลอริก 2 หยด ทำให้ผสมกัน ทิ้งไว้ 4-5 นาที จากนั้นนำไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 665 นาโนเมตร และ 750 นาโนเมตร อีกครั้ง

6. นำไปคำนวณค่าคลอโรฟิลล์ เอ คลอโรฟิลล์ บี คลอโรฟิลล์ ซีและฟีโอไฟตินได้ดังนี้

คลอโรฟิลล์ เอ (μg/L) = [11.64(abs663) -2.16(abs645)+0.10 (abs630)] x vol x 10⁶

คลอโรฟิลล์ บี (μg/L) = [ 20.97(abs645) -3.94 (abs663)-3.66 (abs630)] x vol x 10⁶

คลอโรฟิลล์ ซี (μg/L) = [54.22 (abs630) -14.81 (abs645)-5.53 (abs663)] x vol x 10⁶

ฟีโอไฟติน (μg/L) = 26.7[1.7 (abs665₀) -abs665_a] x vol

เมื่อ vol = ปริมาตรสารละลายอะซีโตนที่ใช้สกัด(มิลลิลิตร) และ VOL= ปริมาตรน้ำที่กรอง(ลิตร)
abs630, abs645 และ abs663 = ค่า abs ที่ปรับแก้ด้วยค่า abs750 แล้ว
และ abs663₀ และ abs663a = ค่า abs ก่อนและหลังจากเติมสารละลายกรดไฮโดรคลอริกที่ปรับแก้
ด้วยค่า abs750 แล้ว

วิธีการใช้เครื่องวัดการดูกลืนแสงยี่ห้อ Shimadzu UV-160A เพื่อวัดค่าการดูดกลืนแสงในการวิเคราะห์หาคลอโรฟิลล์

1. เปิดเครื่องทิ้งไว้ 15-30 นาที

2. เลือก mode photometric ตั้งค่า parameter โดยเลือก processing 5λ แล้วตั้งค่า λ ที่ต้องการวัดทั้ง 5 ค่า

3. return กลับไปที่ mode ใหม่ แล้วเลือก mode spectrum ตั้งค่า parameter โดยเลือกช่วงความยาวคลื่นให้ครอบคลุมทั้ง 5λ ที่จะวัด (ใส่แบลงค์ทั้ง 2 ด้าน)

4. return กลับไปที่ mode ใหม่ แล้วเลือก mode condition test แล้วเลือกข้อ 1 base line หลังจากเครื่องทำ baseline ผ่านแล้วให้ย้อนกลับไปที่ mode photometric อีกครั้ง

5. ให้กด start (ใน mode photometric) เพื่อทดสอบดูว่าค่าเป็นศูนย์ทั้ง 5λ หรือไม่แล้วจึงค่อยใส่ตัวอย่างลงในช่อง sample แล้วกด start เพื่อทำการวัดตัวอย่างต่อไป