การวิเคราะห์หาค่าบีโอดี (Biochemical Oxygen Demand, BOD5)

หลักการวิเคราะห์หาค่าบีโอดี

ระยะที่ 1 เป็นการออกซิไดส์สารประกอบของคาร์บอน ดังสมการ

สารอินทรีย์ + O₂ + ธาตุอาหาร ---------> CO₂ + H₂O + เซลล์ใหม่ + ธาตุอาหาร + พลังงาน

ระยะที่ 2 เป็นการออกซิไดส์สารประกอบไนโตรเจนโดย autotrophic bacteria ในกลุ่ม nitrifying bacteria การเจริญเติบโตของแบคทีเรียกลุ่มนี้ที่ 20 องศาเซลเซียส มีน้อยมาก ดังนั้นปริมาณออกซิเจนที่แบคทีเรียกลุ่มนี้ใช้ในช่วง 5 วันแรกจึงมีน้อยมาก

การหาค่าบีโอดีเป็นวิธีการทางชีววิเคราะห์ (Bioassay) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการวัดค่าออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ย่อยสารอินทรีย์ในน้ำภายใต้สภาวะที่เหมือนกับที่เกิดในธรรมชาติมากที่สุด เพื่อที่จะให้การวิเคราะห์เป็นปริมาณวิเคราะห์จึงต้องทำให้ปัจจัยต่าง ๆ ที่มีอิทธิพลต่ออัตราการย่อยสลายคงที่ นั่นคือ

ค่าบีโอดีมาตรฐานจะใช้บ่มที่อุณหภูมิ 20+1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน สาเหตุที่ใช้อุณหภูมิและเวลาดังกล่าวก็เพราะที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส nitrifying bacteria เจริญเติบโตได้ช้าที่อุณหภูมินี้ ส่วนการเลือกใช้เวลาบ่ม 5 วัน ก็เพราะถ้าใช้เวลามากกว่านี้ การย่อยสลายสารอินทรีย์โดยแบคทีเรียจะเกิดขึ้นน้อยมาก และเพื่อหลีกเลี่ยงการใช้ออกซิเจนในระยะที่ 2 ดังกล่าวข้างต้น ค่าบีโอดีที่ใช้เวลาบ่ม 5 วัน ใช้สัญลักษณ์ BOD₅

ความสำคัญของค่าบีโอดี

1. เพื่อหากำลังความสกปรกของน้ำเสียต่างๆ ในแง่ของออกซิเจนที่ต้องการใช้เพื่อออกซิไดส์สารอินทรีย์

2. ใช้ในการควบคุมความสกปรกของแหล่งน้ำว่าควรจะกำจัดสารอินทรีย์ที่จะทิ้งลงน้ำแค่ไหน เพื่อที่จะให้มีระดับออกซิเจนเหลืออยู่ตามต้องการ

3. ใช้วัดความสามารถของแหล่งน้ำที่จะกำจัดความสกปรกโดยธรรมชาติ

4. ใช้ตรวจสอบคุณภาพของน้ำทิ้ง

5. ใช้ในการออกแบบระบบบำบัดน้ำเสีย

ที่มา : Tchobanoglous and Schroeder (1987)

ในการหาค่าบีโอดีของน้ำควรคำนึงถึงปัจจัยต่างๆ ที่จะทำให้ผลการวิเคราะห์ที่ได้มีค่าแน่นอนเชื่อถือได้ดังนี้

1. ใช้อุณหภูมิ 20 ± 1 องศาเซลเซียส ในการบ่มเป็นเวลา 5 วัน

2. ไม่ควรให้ตัวอย่างสัมผัสกับอากาศและแสงสว่าง เพื่อป้องกันการเติมออกซิเจนจากการสังเคราะห์แสง (โดยบ่มในตู้มืด ปิดจุกขวดให้แน่น และใช้น้ำกลั่นหล่อเลี้ยงบนจุกขวดเสมอ)

3. น้ำบางชนิดมีความสกปรกมากจะต้องทำให้เจือจางก่อน มิฉะนั้นออกซิเจนในน้ำอาจไม่พอตลอดช่วงของการทดลอง ปกติการเจือจางสำหรับ raw sewage ใช้ 1-5 เปอร์เซ็นต์ ส่วนน้ำธรรมชาติทั่วๆ ไป ใช้ 25-100 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้จะต้องให้ปริมาณออกซิเจนลดน้อยลงไปอย่างน้อย 2 mg/L และเหลือออกซิเจนอยู่อย่างน้อย 1 mg/L

4. น้ำที่ใช้เจือจางควรปราศจากสารที่ไปยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย เช่น ทองแดง คลอรีน นอกจากนี้ควรมีพีเอชที่เหมาะสม คือประมาณ 7 และประกอบด้วยธาตุอาหารที่จำเป็นตลอดจนสารอื่นๆ ที่แบคทีเรียต้องการ เช่น ฟอสฟอรัส ไนโตรเจน เหล็ก แคลเซียม และแมกนีเซียม ข้อสำคัญ น้ำสำหรับใช้เจือจางจะต้องอิ่มตัวด้วยออกซิเจน และเพื่อให้แน่ใจว่าน้ำสำหรับใช้เจือจางไม่มีสารหรือสิ่งที่จะไปยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ในการวิเคราะห์บีโอดีทุกครั้งจึงควรมีตัวอย่างที่มาตรฐาน เช่น ใช้กลูโคสหรือกรดกลูตามิควิเคราะห์ควบคู่กันไปด้วย น้ำเจือจางที่ดีควรจะมีค่าบีโอดีไม่เกิน 0.2 mg/L

5. การเติมเชื้อ (seeding) เนื่องจากในน้ำตัวอย่างบางประเภทมีแบคทีเรียที่จะย่อยสารอาหารไม่เพียงพอ ดังนั้น จึงต้องเติมแบคทีเรียชนิดต่าง ๆ ซึ่งพบมากในน้ำเสียจากอาคารบ้านเรือนลงไปด้วย เรียกแบคทีเรียที่เติมลงไปว่า น้ำเชื้อ (seed)

6. สำหรับน้ำทะเลในแหล่งน้ำธรรมชาติหรือนากุ้ง การเติมสารละลายบัฟเฟอร์และน้ำเชื้ออาจไม่มีความจำเป็น เพราะในน้ำทะเลหรือนากุ้งมีค่าความเป็นด่างและความกระด้างของน้ำสูงมากซึ่งเป็นบัฟเฟอร์ที่ดีอยู่แล้ว และปริมาณแบคทีเรียก็อยู่ในระดับเพียงพอยกเว้นน้ำจากนากุ้งที่มีการใช้ยาฆ่าเชื้อโรคต่างๆ

การเก็บรักษาตัวอย่าง

การวิเคราะห์หาค่าบีโอดีใช้ตัวอย่างน้ำอย่างน้อย 1-2 ลิตร เมื่อเก็บตัวอย่างน้ำมาแล้วควรทำการวิเคราะห์ให้เร็วที่สุด เพราะส่วนประกอบของตัวอย่างน้ำอาจจะเปลี่ยนไปอันเนื่องจากกิจกรรมของสิ่งมีชีวิต APHA, AWWA and WEF (1995) ได้แนะนำวิธีการเก็บรักษาตัวอย่างน้ำสำหรับการวิเคราะห์หาค่าบีโอดีไว้ดังนี้

1. ตัวอย่างน้ำประเภท grab samples หากวิเคราะห์หาค่าบีโอดีได้ภายในเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากเก็บตัวอย่างไม่จำเป็นต้องแช่เย็นตัวอย่าง ถ้าวิเคราะห์ไม่ทันภายในเวลาดังกล่าวให้เก็บรักษาตัวอย่างน้ำไว้ด้วยการแช่เย็นอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ซึ่งสามารถเก็บตัวอย่างไว้ได้นาน 6-24 ชั่วโมง และก่อนจะทำการวิเคราะห์จะต้องวางตัวอย่างน้ำทิ้งไว้ให้มีอุณหภูมิใกล้เคียงกับอุณหภูมิห้องเสียก่อน

2. ตัวอย่างน้ำประเภท composite samples ในการเก็บรักษาตัวอย่างน้ำประเภทนี้ให้เก็บรักษาตัวอย่างแต่ละตัวอย่างก่อนที่จะนำผสมรวมกันด้วยการแช่เย็นอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ซึ่งสามารถเก็บตัวอย่างไว้ได้นาน 24 ชั่วโมง เมื่อนำตัวอย่างแต่ละตัวอย่างมาผสมกันแล้วควรวิเคราะห์ทันที

การวิเคราะห์หาค่าบีโอดี

การหาค่าบีโอดีของน้ำนั้นแบ่งออกได้เป็น 2 วิธีขึ้นอยู่กับความสกปรกมากน้อยของน้ำ คือ

1. direct method ใช้ในกรณีที่ตัวอย่างมีค่าบีโอดีไม่เกิน 7 mg/L ไม่จำเป็นต้องนำตัวอย่างนั้นมาเจือจาง สามารถหาค่าบีโอดีได้เลย

2. dilution method ใช้ในกรณีที่น้ำตัวอย่างมีค่าบีโอดีเกิน 7 mg/L

การวิเคราะห์หาค่าบีโอดีด้วยวิธี direct method

การหาค่าบีโอดีโดยตรงมีขั้นตอนดังนี้

1. เติมออกซิเจนลงในน้ำตัวอย่าง

2. ถ่ายน้ำตัวอย่างที่อิ่มตัวด้วยอากาศลงในขวดบีโอดี 2 ขวด

3. นำขวดบีโอดีขวดที่ 1 มาหาค่า DO ของจุดเริ่มต้น (DO₀ ) ส่วนขวดบีโอดีขวดที่ 2 นำไปบ่มที่ตู้บ่มบีโอดี 20 ± 1 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 วัน แล้วนำมาหาค่า DO ของวันที่ 5 (DO₅ )

4. BOD5 = DO₀ - DO₅

การวิเคราะห์ค่าบีโอดีด้วยวิธี dilution method

ในการวิเคราะห์หาค่าบีโอดีด้วยวิธี dilution method มีข้อควรคำนึงดังนี้

1. การเจือจาง การวิเคราะห์หาค่าบีโอดีด้วยวิธีนี้ใช้กับตัวอย่างน้ำที่มีความสกปรกมาก เช่น น้ำเสียจากบ้านเรือน น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรม น้ำเหล่านี้จะมีค่าบีโอดีสูงเกินความเข้มข้นของออกซิเจนละลายที่มีอยู่ในตัวอย่างที่อิ่มตัวด้วยอากาศ (air-saturated sample) ดังนั้นถ้าไม่ทำให้ตัวอย่างเจือจางลง ปริมาณออกซิเจนในตัวอย่างจะไม่พอที่จะใช้ย่อยสลายสารอินทรีย์ในน้ำ นั่นคือ วัดค่า DO₅ ไม่ได้เนื่องจากเป็นศูนย์ ดังนั้นจึงต้องทำให้น้ำนั้นเจือจางก่อน น้ำสำหรับใช้เจือจางต้องไม่มีสารอินทรีย์ที่ย่อยสลายได้ สารที่ยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย เช่น คลอรีน โลหะหนักต่างๆ น้ำสำหรับใช้เจือจางอาจเป็นน้ำจากธรรมชาติ น้ำกลั่น หรือน้ำประปาก็ได้ ปกติมักใช้น้ำกลั่นแล้วนำมาเติมสารอาหารต่างๆ ที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย รวมทั้งเติมบัฟเฟอร์ลงไปเพื่อควบคุมพี
เอชให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสมกับสำหรับการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ข้อสำคัญคือควรจะเป็นน้ำที่กลั่นจากเครื่องแก้ว เพราะจะได้ไม่มีทองแดงซึ่งเป็นสารมีพิษ น้ำจากแม่น้ำลำธารมีข้อเสียคือ มีสาหร่าย ค่าบีโอดีชนิดและจำนวนของแบคทีเรีย รวมทั้งปริมาณเกลือแร่ไม่คงที่จึงไม่นิยมใช้

สำหรับน้ำทะเลหรือน้ำจากนากุ้ง น้ำที่ใช้เจือจางควรใช้น้ำทะเลเทียมที่มีความเค็มใกล้เคียงกับน้ำตัวอย่าง หรือใช้น้ำทะเลบริเวณชายฝั่งที่สะอาดมาปรับความเค็มให้ใกล้เคียงกับน้ำตัวอย่าง แต่ต้องทำการเติมอากาศลงไปในน้ำที่จะนำมาเจือจางก่อน 5-10 วัน เพื่อลดปริมาณสารอินทรีย์ลงให้น้อยที่สุด (โดยการย่อยสลาย) ก่อนนำมาเป็นน้ำสำหรับใช้เจือจาง (ชนินทร์ และคณะ, 2545)

2. วิธีการเจือจาง ปกติควรทำ 3 dilution แต่ถ้าทราบความเข้มข้นคร่าวๆ ก็อาจทำเพียง 2 dilution และผลของบีโอดีที่ได้จากการเจือจางที่ทำให้ออกซิเจนลดลงมากกว่า 2 mg/L และมีออกซิเจนเหลืออยู่อย่างน้อย 0.5 mg/L จึงจัดได้ว่าเป็นค่าที่เชื่อถือได้ การเจือจางอาจใช้แบบ percent mixture หรือ direct pipetting ลงสู่ขวดขนาด 300 มิลลิลิตร โดยตรงเลยก็ได้ แต่ส่วนมากนิยมแบบแรกเพราะให้ค่าแน่นอนกว่า ในการหาค่าบีโอดีของตัวอย่าง ถ้าทราบค่าโดยประมาณก่อนจะทำให้สะดวกในการเจือจางมากซึ่งส่วนใหญ่อาจประมาณได้จากค่าซีโอดี (ประมาณ 60 เปอร์เซ็นต์ของค่าซีโอดี) หรือจากชนิดของน้ำ จากค่าโดยประมาณอาจใช้ตารางที่ 18 เพื่อพิจารณาดูว่าจะใช้การเจือจางเท่าไหร่ดี อย่างเช่น ถ้าน้ำตัวอย่างมีค่าบีโอดีโดยประมาณ 4 mg/L จากตารางที่ 18 จะเห็นว่าควรใช้การเจือจาง 1 : 2 ซึ่งจะคลุมค่าบีโอดีที่จะหาในช่วงตั้งแต่ 4-12 mg/L เมื่อเลือกสัดส่วนในการเจือจางที่คาดว่าจะให้ค่าบีโอดีอยู่ในช่วงที่กำหนดให้แล้ว จึงเลือกสัดส่วนในการเจือจางตัวอย่างที่สูงกว่าและต่ำกว่าที่อยู่ติดกัน

สำหรับน้ำจากนากุ้งในช่วงเดือนที่ 3-4 ค่าบีโอดีจะอยู่ในช่วง 8-20 mg/L สัดส่วนในการเจือจางควรใช้ 1: 2-1:5 เท่านั้น (ชนินทร์ และคณะ, 2545)

3. การเติมน้ำเชื้อ (seeding) วัตถุประสงค์ของการเติมน้ำเชื้อก็เพื่อต้องการให้มีจำนวนแบคทีเรียพอเพียงในการย่อยสลายสารอินทรีย์ในน้ำเสีย ตัวอย่างน้ำที่มีแบคทีเรียเป็นจำนวนมากอยู่แล้ว (อย่างเช่นน้ำโสโครกจากบ้านเรือนหรือน้ำทิ้งที่ไม่มีคลอรีน น้ำผิวดิน และน้ำจากบ่อเลี้ยงสัตว์น้ำ เป็นต้น)จึงไม่จำเป็นต้องเติมน้ำเชื้อเพราะมีแบคทีเรียอยู่เป็นจำนวนมากแล้ว น้ำตัวอย่างบางประเภทจะมีแบคทีเรียอยู่น้อยมากหรือไม่มีเลย เช่น น้ำทิ้งที่ผ่านการฆ่าเชื้อด้วยคลอรีน น้ำทิ้งที่อุณหภูมิสูง น้ำทิ้งที่เป็นกรดหรือด่างสูง จะต้องเติมน้ำเชื้อลงในน้ำที่จะใช้เจือจาง น้ำเชื้อได้จากน้ำโสโครกจากบ้านเรือนซึ่งปล่อยให้ตกตะกอนและใส่ไว้ในตู้บ่มที่ 20 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24-36 ชั่วโมง จึงดูดเอาน้ำส่วนบนมาใช้การเติมน้ำเชื้อสามารถเติมลงในน้ำสำหรับเจือจาง (โดยทั่วไปใช้น้ำเชื้อมาตรฐาน 1-2 มิลลิลิตรต่อน้ำที่ใช้เจือจาง 1 ลิตร) หรือเติมลงในกระบอกตวงแต่ละใบก่อนการเจือจางก็ได้

4. ขวดที่ใช้บ่ม ขวดที่ใช้ในการหาค่าบีโอดีควรเป็นขวดแก้วที่มีจุกปิดเพื่อป้องกันไม่ให้อากาศเข้าไปได้ ขวดที่ใช้จะต้องสะอาดไม่มีสารอินทรีย์อยู่ ขวดใหม่ก่อนนำมาใช้ควรล้างด้วยกรดไฮโดรคลอริกหรือกรดซัลฟูริก 10 เปอร์เซ็นต์ สำหรับขวดที่ใช้แล้วทำความสะอาดด้วยน้ำยาสำหรับทำความสะอาดเครื่องแก้วในห้องปฏิบัติการ แล้วล้างด้วยน้ำกลั่นจนสะอาด ไม่ควรล้างขวดที่ใช้หาค่าบีโอดีด้วยกรดโครมิก เพราะโครมิกบางส่วนอาจติดค้างอยู่ในขวด

น้ำยาเคมีและวิธีเตรียม

1. น้ำบริสุทธิ์

น้ำบริสุทธิ์ใช้เตรียมน้ำสำหรับการเจือจาง ซึ่งพบว่าน้ำปราศจากอิออน (deionised water) เหมาะที่จะใช้เป็นน้ำเจือจาง หากใช้น้ำกลั่น ควรใช้น้ำกลั่นที่มีทองแดงน้อยกว่า 0.01 mg/L และปราศจากคลอรีน คลอรามีน สารอินทรีย์และกรด

ตาราง  สัดส่วนการเจือจางสำหรับตัวอย่างน้ำที่ใช้วิเคราะห์หาค่าบีโอดี

2. สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์

ละลายโปแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (KH₂ PO₄) 8.5 กรัม ไดโปแทสเซียมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K₂HPO₄) 21.75 กรัม ไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟตเฮปตะไฮเดรต (Na₂HPO₄. 7H₂O) 33.4 กรัม และแอมโมเนียมคลอไรด์ (NH₄Cl) 1.7 กรัม ในน้ำกลั่น 500 มิลลิลิตร แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ ปริมาตร 1 ลิตร พีเอชของสารละลายนี้ควรจะประมาณ 7.2

3. สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต

ละลายแมกนีเซียมซัลเฟตเฮปตะไฮเดรต (MgSO₄.7H₂O) 22.5 กรัม ในน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรให้ได้ 1 ลิตร

4. สารละลายเฟอร์ริคคลอไรด์

ละลายเฟอร์ริคคลอไรด์เฮกซะไฮเดรต (FeCl₃.6H₂O) 0.25 กรัม ในน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรให้ได้ 1 ลิตร

5. สารละลายแคลเซียมคลอไรด์

ละลายแคลเซียมคลอไรด์ (CaCl₂) 27.5 กรัม ในน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรให้ได้ 1 ลิตร

6. สารละลายกรดและด่าง 1 นอร์มอล

สารละลายกรดและด่าง 1 นอร์มอล ใช้ในการปรับค่าพีเอชของตัวอย่างให้เป็นกลาง

7. สารละลายโซเดียมซัลไฟด์ 0.025 นอร์มอล

ละลายโซเดียมซัลไฟด์ (NaSO₃) 1.575 กรัม ในน้ำกลั่น 1 ลิตร สารละลายนี้ไม่เสถียร ต้องเตรียมทันทีก่อนใช้

ขั้นตอนวิเคราะห์

1. การเตรียมน้ำสำหรับใช้เจือจาง

1) ตวงน้ำปราศจากอิออน หรือน้ำกลั่นให้มากกว่าปริมาตรที่จะใช้ทั้งหมดเล็กน้อยใส่ในภาชนะที่สะอาด

2) เป่าอากาศที่สะอาดเพื่อเพิ่มปริมาณออกซิเจนในน้ำเจือจาง อย่างน้อย 1 ชั่วโมง

3) เติมสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ แมกนีเซียมซัลเฟต แคลเซียมคลอไรด์และเฟอริคคลอไรด์ อย่างละ 1 มิลลิลิตร ต่อน้ำเจือจาง 1 ลิตร

2. การเตรียมตัวอย่างน้ำที่จะวิเคราะห์

1) ตัวอย่างน้ำควรมีพีเอชอยู่ระหว่าง 6.5-8.5 หากพีเอชต่ำหรือสูงกว่านี้ ปรับพีเอชให้อยู่ใูนช่วงดังกล่าวด้วยกรดซัลฟูริกหรือโซเดียมไฮดรอกไซด์ 1 นอร์มอล แล้วแต่กรณี (การปรับพีเอชของน้ำตัวอย่างให้เป็นกลางทำได้โดยตวงตัวอย่างน้ำมาประมาณ 50 มิลลิลิตร ค่อยๆ เติมกรดซัลฟูริกหรือโซเดียมไฮดรอกไซด์ 1 นอร์มอล แล้วแต่กรณีเพื่อให้ตัวอย่างน้ำมีพีเอชประมาณ 7 นำปริมาตรของกรดซัลฟูริกหรือโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่ใช้ไปมาคำนวณหาปริมาณของกรดหรือด่างเพื่อปรับพีเอชของตัวอย่างน้ำที่จะใช้หาบีโอดีให้เป็นกลาง)

2) ตัวอย่างที่มีออกซิเจนละลายอิ่มตัวยวดยิ่ง ตัวอย่างจากแหล่งน้ำที่มีแพลงก์ตอนพืชชุกชุมอาจมีออกซิเจนละลายสูงกว่าจุดอิ่มตัว ถ้าหากนำตัวอย่างนั้นมาหาค่าบีโอดีโดยที่ไม่ต้องเจือจาง ควรลดออกซิเจนละลายจนอยู่ในขั้นอิ่มตัว (เอาตัวอย่างน้ำใส่ขวดแล้วเขย่าแรงๆ หรือโดยการเป่าอากาศลงไป) ทั้งนี้เพื่อป้องกันการสูญเสียออกซิเจนละลายระหว่างการเพาะเลี้ยง

3. วิธีการเจือจาง

1) เลือกสัดส่วนในการทำเจือจางที่คาดว่าจะให้ค่าบีโอดีอยู่ในช่วงที่กำหนดแล้ว จึงเลือกเปอร์เซ็นต์ที่สูงกว่าและต่ำกว่าที่อยู่ติดกันตามตาราง (หากทราบค่าบีโอดีคร่าวๆ แล้วใช้สัดส่วนในการทำเจือจางเดียวก็พอ) ดังนั้นจึงจำเป็นต้องรู้ค่าบีโอดีโดยประมาณก่อน ปกติแล้วใช้เปอร์เซ็นต์เจือจางดังนี้ น้ำทิ้งที่มีความสกปรกสูง 0.1-1.0 เปอร์เซ็นต์ น้ำทิ้งที่ไม่ผ่านการบำบัด และน้ำทิ้งที่ปล่อยให้ตกตะกอนเอง 1-5 เปอร์เซ็นต์ น้ำทิ้งผ่านการบำบัดด้วยวิธีชีวภาพ 5-25 เปอร์เซ็นต์ และน้ำจากแหล่งน้ำธรรมชาติ 25-100 เปอร์เซ็นต์

2) เตรียมขวดบีโอดีตัวอย่างละ 2 ชุด ชุดที่ 1 สำหรับการวิเคราะห์หาบีโอดีเริ่มต้น (DO₀) และชุดที่ 2 สำหรับตัวอย่างที่ใช้บ่มในตู้บีโอดีที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส นาน 5 วัน

3) รินน้ำสำหรับเจือจางประมาณ 300-500 มิลลิลิตร ลงในกระบอกตวงขนาด 1 ลิตร โดยพยายามอย่าให้มีฟองอากาศ

4) เติมตัวอย่างน้ำตามจำนวนที่ต้องการ ( ตัวอย่างน้ำควรมีอุณหภูมิใกล้เคียงกับอุณหภูมิห้อง และผสมกันดีก่อนนำมาเจือจาง) แล้วเติมน้ำเจือจางจนได้ปริมาตร 1 ลิตร หากใช้น้ำตัวอย่างน้อยกว่า 5 มิลลิลิตร จะต้องเจือจางตัวอย่างน้ำนั้นเสียก่อน แล้วนำตัวอย่างที่เจือจางแล้วนี้ไปใช้ในการเจือจางขั้นสุดท้าย

5) ใช้แท่งแก้วคนให้เข้ากัน อย่าให้มีฟองอากาศ

6) ถ่ายน้ำจากกระบอกตวงลงสู่ขวดบีโอดีด้วยวิธีกาลักน้ำ (ปล่อยน้ำช่วงแรกทิ้งอย่างน้อย 50 มิลลิลิตร) ปิดจุก นำไปบ่มในตู้บีโอดีที่ 20 องศาเซลเซียส (ก่อนนำไปบ่มเติมน้ำเจือจางที่ปากขวดบีโอดี แล้วปิดด้วยฝาครอบ (cap) หรือฟอยล์ เพื่อป้องกันไม่ให้น้ำหล่อเลี้ยงแห้ง) ส่วนขวดอีกชุดหนึ่งนำไปวิเคราะห์หาออกซิเจนละลายทันที เป็นค่าออกซิเจนละลายที่จุดเริ่มต้น (DO₀)

7) การเตรียมแบลงค์ ทำได้โดยตวงน้ำสำหรับเจือจางใส่ขวดบีโอดี 2 ชุด ชุดแรกนำไปวิเคราะห์หาออกซิเจนละลาย (B₀) ส่วนชุดที่ 2 นำไปบ่มในตู้บีโอดีที่ 20 องศาเซลเซียส โดยปฏิบัติเช่นเดียวกับตัวอย่าง ควรทำแบลงค์อย่างน้อย 3 ซ้ำ

8) เมื่อบ่มครบ 5 วัน นำไปวิเคราะห์หาออกซิเจนละลายด้วยวิธี azide modification

4. การพิจารณาผลเพื่อใช้คำนวณค่าบีโอดี ผลที่น่าเชื่อถือและจะใช้คำนวณต่อไปได้นั้นจะต้องมีค่าปริมาณออกซิเจนละลายเหลืออยู่อย่างน้อย 1 mg/L และปริมาณออกซิเจนละลายต้องลดลงไปอย่างน้อย 2 mg/L ของตัวอย่างที่ทำการเจือจางจึงจะทำให้ค่าบีโอดีที่คำนวณออกมาได้นั้นถูกต้องที่สุด สำหรับแบลงค์ของน้ำเจือจางในกรณีที่น้ำเจือจางไม่ได้เติมน้ำเชื้อนั้นปริมาณออกซิเจนที่ได้ในตอนแรกและตอนหลัง (5 วัน) ไม่ควรลดเกินกว่า 0.2 mg/L หรือที่ดีแล้วไม่ควรลดเกิน 0.1 mg/L

5. การคำนวณ

ในกรณีน้ำเจือจางไม่ได้เติมน้ำเชื้อ

DO₀ = ปริมาณออกซิเจนละลายของตัวอย่างเริ่มต้น (ชุดที่ 1)

DO₅ = ปริมาณออกซิเจนละลายของตัวอย่างหลังจากบ่มเป็นเวลา 5 วัน (ชุดที่ 2)

B₀ = ปริมาณออกซิเจนละลายของแบลงค์เริ่มต้น

B₅ = ปริมาณออกซิเจนละลายของแบลงค์หลังจากบ่มไว้เป็นเวลา 5 วัน

6. Glucose-glutamic acid check เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีสารพิษ หรือใช้น้ำเชื้อที่ไม่ดีอันเป็นเหตุให้ผลที่ได้มีค่าต่ำ ดังนั้นจึงควรตรวจดูคุณภาพของน้ำเจือจาง ผลของน้ำเชื้อที่เติม และเทคนิคต่างๆ โดยใช้สารอินทรีย์บริสุทธิ์ซึ่งทราบค่าบีโอดี ปกติใช้ glucose และ glutamic acid (ที่อบให้แห้งที่ 103 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง) อย่างละ 150 มิลลิกรัม ในน้ำกลั่น 1 ลิตร สารละลายนี้ควรเตรียมใหม่ทุกครั้งเมื่อวิเคราะห์ เตรียมสารละลายนี้ด้วยสัดส่วนการเจือจาง 1 ต่อ 50 ด้วยน้ำเจือจาง แล้วทำเช่นเดียวกับตัวอย่างปกติ ค่าบีโอดีที่ได้ควรประมาณ 220 mg/L ถ้าค่าที่ได้ต่ำกว่า 200 mg/L หรือสูงกว่า 240 mg/L แสดงว่ามีความผิดปกติเกิดขึ้น อาจเนื่องจากน้ำเจือจาง น้ำเชื้อ หรือเทคนิคการวิเคราะห์

ที่มา : Tchobanoglous and Schroeder (1987)